Transkriptomska analiza mikroglije nakon infekcije citomegalovirusom


Humani citomegalovirus (HCMV), također poznat i kao humani herpesvirus 5 (HHV-5), široko je rasprostranjen virus u ljudskoj populaciji koji, nakon primarne, uspostavlja latentnu infekciju i ostaje prisutan u organizmu domaćina za vrijeme cijelog života (Cannon, Schmid et al. 2010). HCMV posjeduje širok dijapazon staničnog tropizma – inficira fibroblaste, endotelne stanice, epitelne stanice, monocite/makrofage, stanice glatkog mišićja, stromalne stanice, stanice živčanog sustava, neutrofile, trofoblaste i hepatocite (Sinzger, Digel et al. 2008). Iako zbog toga virus može diseminirati u različite organe i tkiva, u imunokompetentnih osoba infekcija uglavnom prolazi neprimijećena ili praćena tek blagim simptomima. Ipak, u ~10% slučajeva virus može uzrokovati sindrom nalik na mononukleozu: dugotrajne epizode vrućice, opću slabost, limfocitozu, te blagi do umjereni poremećaj funkcije jetre (Eddleston, Peacock et al. 1997).

Nasuprot imunokompetentnih, kod osoba sa suprimiranim ili nezrelim imunosnim sustavom, infekcija HCMV-om može rezultirati višestrukom upalom organa i/ili tkiva, te kliničkom slikom opasnom po život (Boeckh and Geballe 2011), a najosjetljiviji dio populacije su trudnice i novorođenčad. Naime, citomegalovirus je vodeći uzročnik transplacentalnih infekcija novorođenčadi koje rezultiraju širokim rasponom strukturalnih i funkcionalnih poremećaja ploda, primjerice trajnim neurološkim oštećenjima poput gluhoće, mikrocefalije, mentalne retardacije ili cerebralne paralize (Boppana B. 2013). Primarna infekcija, ili reinfekcija drugim sojem CMV-a, često prolazi bez ikakvih primjetnih simptoma, pa trudnice često nisu niti svjesne tekuće infekcije i opasnosti za plod. Osim toga, čak do 90% kongenitalno inficirane novorođenčadi ne pokazuje nikakve simptome infekcije, premda i u takvim slučajevima postoji povećan rizik za razvoj trajnih neuroloških oštećenja (Fowler and Boppana 2006, Boppana, Ross et al. 2013, Karltorp, Löfkvist et al. 2014).

Unatoč brojnim naporima, patogeneza infekcije citomegalovirusom u središnjem živčanom sustavu (SŽS) je nedovoljno istražena i nisu u potpunosti razjašnjeni mehanizmi koji dovode do nastanaka gore spomenutih oštećenja i abnormalnosti. Jedna od prepreka boljem razumijevanju kongenitalne citomegalovirusne infekcije je svakako visoka specifičnost HCMV-a za vrstu. Naime, HCMV inficira samo ljude te se ne može koristiti u pokusima na eksperimentalnim životinjama. Na sreću, mišji citomegalovirus (MCMV) je po svim bitnim biološkim svojstvima visoko srodan HCMV-u, te se stoga dugi niz godina uspješno koristi kao istraživački model za izučavanje svih aspekata biologije HCMV-a: od humoralnog i staničnog imunološkog odgovora domaćina, preko infekcija imunosuprimiranih domaćina pa sve do kongenitalnih infekcija (Cekinovic, Lisnic et al. 2014).

No iako blisko srodan HCMV-u, MCMV ne može premostiti placentalnu barijeru i uzrokovati intrauterinu infekciju. Stoga pojedini istraživači infekciju nerazvijenog središnjeg živčanog sustava uspostavljaju izravnim intrakranijalnim iniciranjem virusa u novokoćene miševe ili mišje embrije in utero. Međutim, ovakav način infekcije može uzrokovati nenamjerna kolateralna fizička oštećenja moždano-tkivne barijere i samog mozga prilikom iniciranja virusa. Kako bismo zaobišli navedene nedostatke, u našem smo laboratoriju razvili eksperimentalni sustav u kojem prirođenu infekciju CMV-om modeliramo intraperitonealnom infekcijom novookoćenih miševa dan nakon njihova okota (Britt, Cekinovic et al. 2013). Novookoćeni miševi na razvojnom su stadiju koji je ekvivalentan stadiju razvoja ljudskog fetusa u drugom trimestru trudnoće (Slavuljica, Kvestak et al. 2015) te stoga predstavljaju izrazito pogodan sustav za proučavanje patogeneze prirođene infekcije CMV-om u središnjem živčanom sustavu (Slavuljica, Kveštak et al. 2015). Štoviše, naša je grupa u nekoliko zapaženih istraživanja pokazala da ovakav način infekcije novookoćenih miševa MCMV-om u potpunosti prati tijek, simptome i karakteristike kongenitalne infekcije ljudi HCMV-om, poput a) visoke sistemske viremije tijekom koje se virus replicira u brojnim organima praćene snažnim proupalnim imunim odgovorom; b) multifokalni encefalitis praćen brojnim infiltratima imunih stanica u moždani parenhim i c) dugotrajni razvojni poremećaji (Cekinovic, Lisnic et al. 2014, Brizic, Susak et al. 2018). Od navedenog, infiltracija perifernih i aktivacija rezidentnih imunih stanica je jedna od opasnijih posljedica infekcije središnjeg živčanog sustava CMV-om. Naime, infekcija rezultira snažnim proupalnim odgovorom posredovanim stanicama imunog sustava, a takva snažna upala često za posljedicu ima oštećenje okolnog tkiva. Stoga se u mozgu nalazi vrlo malo rezidentnih imunoloških stanica sa niskim razinama ekspresije molekula tkivne snošljivosti (MHC eng. major histocompatibility complex) (Rock, Gekker et al. 2004, Ousman and Kubes 2012), među ostalim upravo zato da ga se zaštiti od potencijalno razornog djelovanja upale.

Od prisutnih rezidentnih imunološki aktivnih stanica u mozgu najbrojnije su mikroglije, koje još nazivamo i makrofazima mozga. Osim što imaju važnu ulogu tijekom razvoja mozga, kao stanice prirođene imunosti one sudjeluju u ranoj kontroli infekcija, regrutaciji drugih stanica imunog sustava i moduliranju njihovih aktivnosti (Lehnardt 2010, Paolicelli, Bolasco et al. 2011, Miyamoto, Wake et al. 2016, Tsai, Chen et al. 2016). Poput konvencionalnih makrofaga, a ovisno o utjecajima iz okoliša, i mikroglije mogu polarizirati prema proupalnom ili protuupalnom fenotipu, a proupalne mikroglije mogu uzrokovati promjene u drugim vrstama potpornih glija stanica i dovesti do smrti neurona. U sklopu već postojećih istraživanja kongenitalne infekcije CMV-om u našem laboratoriju, nedavno smo otkrili da perinatalna infekcija novookoćenih miševa MCMV-om uzrokuje polarizaciju mikroglije prema proupalnom fenotipu vrlo rano u infekciji i da se njihov proupalni polarizacijski status zadržava čak i do 9 mjeseci nakon akutne infekcije, odnosno izrazito dugo po završetku aktivne replikacije virusa, kada se on već nalazi u stanju latencije. Na temelju ovog rezultata postavili smo hipotezu da je upravo trajna polarizacija mikroglije prema proupalnom fenotipu jedan od važnih čimbenika u razvoju neuroloških oštećenja mozga posredovanih infekcijom citomegalovirusom. Ovu hipotezu nedavno su podržali i rezultati provedenog istraživanja u kojem je pokazano da su neurološki poremećaji kod štakora inficiranih citomegalovirusom uzrokovani promjenama mikroglije (Cloarec, Bauer et al. 2018). Naime, ukoliko se kongenitalno inficiranim štakorskim fetusima depletira mikroglija, ili se spriječi njihova aktivacija, dolazi do značajnog smanjenja neuroloških smetnji kao i smrtnosti samih mladunaca.

Stoga, kako bismo stekli uvid u molekularne promjene na razini ekspresije gena, a time neposredno i u aktivnost molekularnih puteva koji su trajno promijenjeni u mikrogliji polariziranoj prema proupalnom fenotipu nakon infekcije citomegalovirusom, u sklopu ovog istraživanja predlažemo transkriptomsku analizu (RNASeq) mikroglija izoliranih iz perinatalno inficiranih miševa rano i kasno po infekciji. Provedena analiza omogućiti će detaljnu molekularnu karakterizaciju ove do sada nedovoljno istražene subpopulacije imunoloških stanica u mozgu tijekom infekcije, te rezultirati identifikacijom gena i molekularnih mehanizama koji daju glavni doprinos kasnijem razvoju opisanih neuroloških simptoma posredovanih infekcijom CMV-om. Osim toga, ovo istraživanje moglo bi rezultirati otkrićem novih pouzdanih biomarkera za identifkaciju proupalne mikroglije, kao i novih meta za pametne biofarmaceutike, primjerice protutijela, kojima bi se mogla vršiti ciljana, visoko-specifična i za organizam neškodljiva deplecija trajno aktivirane mikroglije i time prevenirati navedene opasne neurološke posljedice infekcije mozga citomegalovirusom. 


Istraživački tim
Mijo Golemac mijo.golmac@medri.uniri.hr
Daria Kveštak darija.kvestak@uniri.hr
Vanda Juranić Lisnić vanda.juranic@uniri.hr

Dr. sc. Berislav Lisnić dipl. ing.

Medicinski fakultet

e-pošta: berislavlisnic@medri.uniri.hr
e-pošta: berislavlisnic@outlook.com
telefon: +385 51 651 247


MEĐUNARODNA VIDLJIVOST:
CITATIH-INDEXI10-INDEX
Citiranost prema Google Scholar 161 6 6
Citiranost prema Scopus 115 6 5
Citiranost prema Web of Science 111 6 5